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UV1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)葉綠素含量的測(cè)定
更新時(shí)間:2019-03-20 點(diǎn)擊次數(shù):7095

葉綠素含量的測(cè)定

 

一、前言

葉綠素廣泛存在國(guó)術(shù)等綠色植物組織中,并在植物細(xì)胞中與蛋白質(zhì)結(jié)合成葉綠體。當(dāng)植物細(xì)胞死亡后,葉綠素即游離出來(lái),游離葉綠素很不穩(wěn)定,對(duì)光、熱比較敏感;在酸性條件下葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素,在稀釋堿液中可水解成鮮綠色的葉綠醇和甲醇。高等植物中葉綠素有兩種;葉綠素ab,兩者均易溶于乙醇、yimi、丙酮和lvfang。

葉綠素的含量測(cè)定方法有多種,其中主要有:

  1. 原子吸收光譜法:通過(guò)測(cè)定鎂元素的含量,進(jìn)而間接計(jì)算葉綠素的含量。
  2. 分光光度法:利用分光光度計(jì)測(cè)定葉綠素提取液在大吸收波長(zhǎng)下的吸光值,即可用朗伯比爾定律計(jì)算出提取液中各色素的含量。
  3. 葉綠素a和葉綠素b645nm663nm處有大吸收,且兩吸收曲線(xiàn)相交于652nm處。因此測(cè)定提取液在645nm、663nm、652nm波長(zhǎng)下的吸光值,并根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式可分別計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。

葉綠素與其他顯色物質(zhì)一樣,在溶液中如液層厚度不變則其吸光度與它的濃度成一定的比例關(guān)系。已知葉綠素a、b652nm波長(zhǎng)處有相同的比吸收系數(shù)(均為34.5)。因此,在此波長(zhǎng)下測(cè)定葉綠素溶液的吸光度,即可計(jì)算出葉綠素a、b的總量。

二、材料、儀器設(shè)備及試劑

  1. 材料:水樣或植物中提取的葉綠素溶液
  2. 儀器設(shè)備:電子分析天平;UV1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);漏斗:25ml容量瓶;剪刀;濾紙;玻棒等。
  3. 試劑:95%乙醇、石英砂、碳酸鈣粉。

四、實(shí)驗(yàn)步驟

  1. 樣品的準(zhǔn)備

2.測(cè)定

1CM的比色皿,倒入樣品,以95%乙醇為空白對(duì)照,在UV1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)625nm波長(zhǎng)下讀取吸光度(A)值。

五.計(jì)算

將測(cè)得的吸光度652nm波長(zhǎng)處的吸光度值輸入儀器公式,即可求得樣品中葉綠素濃度。所得結(jié)果再代入公式,即可得出樣品葉綠素的含量。

                A652

Cmg.ml-1)=    34.5

式中:C=葉綠素(ab)的總濃度(mg.ml-1)

A652------  表示在652nm波長(zhǎng)下測(cè)得樣品中葉綠素的吸光度

34.5為葉綠素ab混合溶液在652nm波長(zhǎng)的比吸收系數(shù)(比色皿光徑為1CM,樣品濃度為1g.L-1時(shí)的吸光度)。

葉綠素含量(mg.g-1Fw=Cmg.ml-1)×提取液總量(mL

                               樣品鮮重(g)

 

方法II

 

  1. 目的

掌握葉綠素a、b含量測(cè)定的基本原理和方法。

2.原理

葉綠素a、b分別在663nm645nm波長(zhǎng)處有大的吸收峰,同時(shí)在該波長(zhǎng)處葉綠素ab的比吸收吸收K為已知,我們即可以根據(jù)朗博比爾定律,列出濃度C與吸光度A之間的關(guān)系式:

A663=82.04Ca+9.27Cb

A645=16.75Ca+45.6Cb

(1)、(2)式中的A663.A645為葉綠素溶液在波長(zhǎng)663nm645nm時(shí)測(cè)得的吸光度。

Ca、Cb為葉綠素ab的濃度,單位為mg,L-1.

82.04、9,27為葉綠素a、b在波長(zhǎng)663nm下的比吸收系數(shù)。

16.75、45.6為葉綠素a、b在波長(zhǎng)645nm下的比吸收系數(shù)。

解(1)、(2)式聯(lián)立方程,得:

Ca=12.70   A663-2.69 A645

Cb=22.9 A645-4.68A663

CT-Ca+Cb=20.21A645+8.02A663

Ca、Cb為葉綠素ab的濃度,CT為總?cè)~綠素濃度,單位:(mg,L-1),利用上面(3,4,5)式可以分別計(jì)算出葉綠素a、b及總?cè)~綠素濃度。

 

三、材料、儀器設(shè)備及試劑

  1. 材料:菠菜葉、薺菜葉或其他植物葉片
  2. 儀器設(shè)備:電子分析天平:分光光度計(jì):恒溫水浴鍋:25ml刻度試管;剪刀;試管;試管架;玻棒等。
  3. 試劑:80%乙醇

四實(shí)驗(yàn)步驟

  1. 葉綠素的提取
  2. 從植株上選取有代表性的葉片數(shù)張(除去粗大葉脈)剪碎后混勻,快速稱(chēng)取0.2g(可視樣品葉綠素含量高低而增減用量),置于25mL刻度試管中,加80%乙醇10ml左右,加塞放入60-80水浴中保溫提取葉綠素(或常溫下放在暗處浸提12~24h),至葉片全部褪綠為止,冷卻后,用80%乙醇定容至刻度,此液即為葉綠素提取液。
  3. 測(cè)定
  4. 取光徑為1CM的比色杯,加入葉綠素提取液距比色皿口1CM處,以80%乙醇作為對(duì)照,調(diào)到UV1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)的多波長(zhǎng)測(cè)量狀態(tài),得出663nm645nm波長(zhǎng)下的吸光度值。

結(jié)果計(jì)算

將測(cè)定得到的吸光度A663、A645值分別代入式中計(jì)算出Ca、CbCT(即葉綠素a、b及葉綠素總量濃度)。再按下式計(jì)算出葉綠素a、b及葉綠素總含量。

葉綠素a含量(mg.g-1Fw)=      Ca×提取液總量(ml)  

                             樣品鮮重(g×1000 

葉綠素b含量(mg,g-1 Fw)=     Cb×提取液總量(ml) 

                                樣品鮮重(g)×1000

葉綠素總含量(mg.g-1Fw)=     CT×提取液總量(ml) 

                                樣品鮮重(g)×1000

后計(jì)算出葉綠素a/葉綠素b的比值,并加以分析。

 

原理

根據(jù)葉綠體色素提取液對(duì)可見(jiàn)光譜的吸收,利用分光光度計(jì)在某一特定波長(zhǎng)測(cè)定其吸光度,即可用公司計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律,某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比,即A=acl   式中a比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分濃度為單位,液層厚度為1CM時(shí),a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各種有色物質(zhì)溶液在不同波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)可通過(guò)測(cè)定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長(zhǎng)下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì),則此混合液在某一波長(zhǎng)下的總吸光度等于各組分在響應(yīng)波長(zhǎng)下吸光度的綜合。這就是吸光度的加和性。此次試驗(yàn)測(cè)定葉綠素混合提取液中葉綠素a、b和類(lèi)胡蘿卜素的含量,只需測(cè)定該提取液在三個(gè)特定波長(zhǎng)下的吸光度A,并根據(jù)葉綠素a、b及類(lèi)胡蘿卜素在該波長(zhǎng)下的吸光系數(shù)即可求出其濃度。在測(cè)定葉綠素a、b 時(shí)為了排除類(lèi)胡蘿卜素的干擾,所用單色光的波長(zhǎng)選擇葉綠素在紅光區(qū)的大吸收峰。

二.材料、儀器設(shè)備及試劑

  • 材料:新鮮(或烘干)的植物葉片。
  • 儀器設(shè)備:1.UV1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì);2。電子頂載天平(感量0.01g);3.研缽;4.棕色容量瓶;5.小漏斗;6.定量濾紙;7.吸水紙;擦境紙;9滴管。
  • 試劑:96%乙醇(或80%丙酮);石英砂;碳酸鈣粉。

三.實(shí)驗(yàn)步驟

  1. 取新鮮植物葉片(或其它綠色組織)或干材料,擦凈組織表面污物,剪碎(去掉中脈)混勻。2.稱(chēng)取剪碎的新鮮樣品0.2g,共3份,分別放入研缽中,加少量石英砂和碳酸鈣粉及2~3mL 95%乙醇,研成均漿,再加乙醇10mL,繼續(xù)研磨至組織變白。靜置3`5min.3.取濾紙1張,置漏斗中,用乙醇濕潤(rùn),沿玻棒把提取液倒入漏斗中,過(guò)濾到25mL棕色容量瓶中,用少量乙醇沖洗研缽、研棒及殘?jiān)鼣?shù)次,后連同殘?jiān)黄鸬谷肼┒分小?/span>4.用滴管吸取乙醇,將濾紙上的葉綠體色素全部洗入容量瓶中。直至濾紙和殘?jiān)袩o(wú)綠色為止。后用乙醇定容至25mL,搖勻。5.把葉綠體色素提取液倒入光徑1CM的比色皿內(nèi),以95%乙醇為空白,在UV1800PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)單機(jī)模式,多波長(zhǎng)測(cè)量中得出 波長(zhǎng)665nm、649nm下的吸光度值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算:將測(cè)定得到的吸光值代入下面的式中:

Ca=13.9665-6.88A649;Cb=24.96A649-7.32A665.據(jù)此即可得到葉綠素a和葉綠素b的濃度(CaCb;mg/L),二者之和為總?cè)~綠素的濃度。后根據(jù)下式可進(jìn)一步求出植物組織中葉綠素的含量;

葉綠素的含量(mg/g)=[葉綠素的濃度×提取液體積×稀釋倍數(shù)】/樣品鮮重(或干重)。

 

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