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UV1901PC紫外可見分光光度計(jì)檢測蛋白質(zhì)的方法
更新時(shí)間:2017-05-08 點(diǎn)擊次數(shù):2835

UV1901PC紫外可見分光光度計(jì)檢測蛋白質(zhì)的方法

 

紫外可見分光光度計(jì)簡介:

隨著現(xiàn)代科技的不斷發(fā)展和進(jìn)步,現(xiàn)代分光光度的測試手段和方法都在不斷改進(jìn),但zui根本的依據(jù)仍然建立在朗伯-比爾定律的基礎(chǔ)之上。

 

A=KLC

   

式中:

A-為被測物在給定波長的需光吸光度值

     K-為一系數(shù),稱為溶液的吸收系數(shù)(與入射光波長及被測物質(zhì)的特性有關(guān))

     L-為被測物質(zhì)的厚度(一般與比色池的厚度有關(guān))

     C-為被測物質(zhì)的濃度

    由上式可以看出,被測物質(zhì)對單色光的吸光度與被測物質(zhì)的濃度成正比。

實(shí)際測試時(shí),單色光通過被測物質(zhì)達(dá)到光電接收器中,由光電倍增管或光電池轉(zhuǎn)換成光電流,而光電流的強(qiáng)弱決定了吸光度值A的大小。假定通過參比樣品的光電流為I。,而通過待測樣品的光電流為I,則兩者之比設(shè)定為τ,也稱透射比(或以T%表示,稱為透過率)。則:

τ=I/ IO×100%

   

朗伯-比爾定律的貢獻(xiàn)就是發(fā)現(xiàn)了透射比的負(fù)對數(shù)值(也就是吸光度A)的變化與物質(zhì)的濃度的變化呈正比關(guān)系。即:

A=-lgτ或lgIO/I=KCL

   

    同時(shí),不同的物質(zhì)對不同波長的單色光呈現(xiàn)出不同的吸光度值,這一變化特征也就是分光光度法用于物質(zhì)的定性定量分析的理論基礎(chǔ)。

基于上述原理,就可以知道無論是以往的儀器還是現(xiàn)在的儀器,其zui基本的工作要求都是能準(zhǔn)確獲得物質(zhì)(或稱樣品)在某一波長的透射比或在某一個(gè)光譜波長范圍的吸光度變化特性(具體說光譜特性譜圖)。而UV1901PC/UV1902PC雙光束紫外可見分光光度計(jì),能同時(shí)測量參比樣品和待測樣品。由于參比樣品和待測樣品是同時(shí)測量的,所以任何由光源帶來的影響都被抵消了,從方法上保證了測量度。

 

UV1901PC紫外可見分光光度計(jì)檢測蛋白質(zhì)的原理:

根據(jù)朗伯-比耳定律:A=εbc,當(dāng)入射光波長λ及光程b一定時(shí),在一定濃度范圍內(nèi),有色物質(zhì)的吸光度A與該物質(zhì)的濃度c成正比.

 

蛋白質(zhì)可作定量分析的原因:蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,所以蛋白質(zhì)溶液在275280nm具有一個(gè)吸收紫外吸收高峰。在一定濃度范圍內(nèi),蛋白質(zhì)溶液在zui大吸收波長處的吸光度與其濃度成正比,服從朗伯-比耳定律,因此可作定量分析。該法測定蛋白質(zhì)的濃度范圍為0.11.0mg/mL。

有嘌呤、嘧啶等核酸類干擾時(shí)的經(jīng)驗(yàn)公式:若樣品中含有嘌呤、嘧啶等核酸類吸收紫外光的物質(zhì),在280nm處來測量蛋白質(zhì)含量時(shí),會有較大的干擾。核酸在260nm處的光吸收比280nm更強(qiáng),但蛋白質(zhì)卻恰恰相反,因此可利用280nm260nm的吸收差來計(jì)算蛋白質(zhì)的含量。常用下列經(jīng)驗(yàn)公式計(jì)算: 

蛋白質(zhì)濃度(mg/mL=1.4280-0.74A260  

(A280A260分別為蛋白質(zhì)溶液在280nm260nm處測得的吸光度值還可以通過下述經(jīng)驗(yàn)公式直接計(jì)算出溶液中的蛋白質(zhì)的含量: 蛋白質(zhì)濃度(mg/mL=F* A280*D*1/d 

其中A280為蛋白質(zhì)溶液在280nm處測得的吸光度值;d為石英比色皿的厚度(cm;D為溶液的稀釋倍數(shù);F為校正因子 

4)稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測定的經(jīng)驗(yàn)公式:蛋白質(zhì)的肽鍵在200250nm有強(qiáng)的紫外吸收。其光吸收強(qiáng)度在一定范圍與濃度成正比,其波長越短,光吸收越強(qiáng)。若選用215nm可減少干擾及光散射,用215nm225nm光吸收差值與單一波長測定相比,可減少非蛋白質(zhì)成分引起的誤差,因此,對稀溶液中蛋白質(zhì)濃度測定,可選用215nm225nm光吸收差法。常用下列經(jīng)驗(yàn)公式: 

蛋白質(zhì)濃度(mg/mL=0.144A215-A225 

A215A225分別為蛋白質(zhì)溶液在215nm225nm處測得的吸光度值。

 

儀器與試劑 

儀器:uv-1901pc紫外-可見分光光度計(jì)

UV1901PC紫外可見分光光度計(jì)特點(diǎn):

采用濱松無臭氧環(huán)保型氘燈,普通長壽命氘燈會有臭氧產(chǎn)生,長期吸入對身體有害,無臭氧長壽命氘燈就可以有效避免。儀器還采用德國歐士朗鎢燈,美國派來芝檢測器,雙光束光學(xué)系統(tǒng),加厚光學(xué)底板,更能保證儀器的穩(wěn)定性。操作界面和操作系統(tǒng)都是簡便快捷版的,減少了檢測時(shí)間的同時(shí),增加準(zhǔn)確性.吸光度可以到小數(shù)點(diǎn)后四位??蛇x配多種附件,自動四聯(lián)池,七聯(lián)池,恒溫裝置,透過率固體架,反射率固體架等。

比色管(10ml5個(gè)),吸量管。 試劑:標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:5.00 mg/mL溶液、0.9% NaCl溶液,待測蛋白質(zhì)溶液(牛血清白蛋白)。

實(shí)驗(yàn)過程:

啟動計(jì)算機(jī),打開主機(jī)電源開關(guān),啟動工作站并初始化儀器,預(yù)熱半小時(shí)。 

用吸量管分別吸取0.6、0.8、1.01.2、1.4mL 5.00 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液于510 mL 比色管中,用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度,搖勻。用1 cm石英比色皿,以0.9%NaCl溶液為參比(參比溶液不可取出)

在工作界面上選擇測量項(xiàng)目為光譜掃描,設(shè)置掃描參數(shù)(起點(diǎn):400nm,終點(diǎn):250nm,速度:中,間隔:1.0nm,單次掃描) 

將兩個(gè)均裝有0.9%NaCl溶液的1cm石英比色皿放入測量池中,進(jìn)行基線掃描,然后選定量測定,校零,在調(diào)回光譜掃描。 

附加:吸收曲線的制作:(找出zui大吸收波長) 

將放在前面的比色皿中溶液換為0.3 mg/mL的蛋白質(zhì)溶液,點(diǎn)擊START進(jìn)行掃描,得到如下吸收曲線,從曲線中我們可以看出此標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液的zui大吸收波長為278nm,此波長下的吸光度為   。  

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作: 

在工作界面上選擇測量項(xiàng)目為光度測量設(shè)置測量條件(測量波長:278.00 nm)。 

1 cm石英比色皿,以0.9%NaCl溶液為參比,在278nm處分別測定以上所配標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度A278,以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:

樣品測定: 

配制三份待測蛋白質(zhì)溶液,(取待測蛋白質(zhì)溶液2.0mL分別于310mL 比色管中,用0.9% NaCl溶液稀釋至刻度)按上述方法測定278 nm處的吸光度。得吸光度依次為0.3906,0.3765,0.3848。平均值為A278=0.3840,根據(jù)樣品溶液的吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出待測蛋白質(zhì)的濃度為0.6101mg/mL。轉(zhuǎn)換后待測蛋白質(zhì)溶液的濃度為C= 0.6101mg/mL 10 mL /2.0mL=3.0505mg/mL。

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